Wie die Bezeichnung „Micky Maus Magazin“ bereits vermuten lässt, nimmt Micky Maus die Hauptrolle in den Geschichten ein. Hierbei tritt Micky meist als Detektiv auf, der das Böse bekämpft. In den Comics kommen für gewöhnlich mehrere Charaktere aus Entenhausen vor. Allen voran folgt Donald Duck sowie mehrere Nebencharaktere.
Diese lassen sich aus Mickys Sicht in Freunde und Feinde gruppieren. Zu Mickys Freunden gehören der tollpatschige Hund Goofy, dessen Dauerverlobte Minnie Maus, Hund Pluto sein Haustier sowie Kommissar Hunter, der die überführten Verbrecher übernimmt. Neben den Panzerknackern und Kater Karlo zählt vor allem das Schwarze Phantom zu den Feinden von Micky Maus.
Zahlreiche Geschichten ereignen sich direkt in Entenhausen und dessen Umgebung. Gelegentlich kommen jedoch auch reale Schauplätze wie Hamburg und der Bodensee als Schauplätze im Micky Maus Magazin vor.
